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用HPLC法测定有关物质有关物质系药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体，以及不同晶体、旋光异构的物质，也可能是制剂生产过程或在贮藏、运输、使用过程中产生的降解产物等。由于有关物质的含量较少，所以选择专属性强、灵敏度高、重现性好的检测方法至关重要。目前常用的方法有HPLC法和TLC法，后法已有讨论。本研究主要阐述HPLC法的建立过程。 HPLC法检测有关物质的方法有： (1)杂质对照品法(适用于已知杂质)； (2)主成分自身稀释对照法(适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得其对照品，简称“自身对照法”)； (3)归一化法(现已不多用)。 前法为外标法、定量检测；后两法均为限量检测。自身对照法又可分为加校正因子计算和不加校正因子计算。目前，国内多采用后法。
专属性是色谱条件建立的关键，通常是采用在被测物对照品(或供试品)中加入适量的杂质或辅料，以验证所选色谱条件能否将各杂质与被测物分离检出。应按1％(w/w)被测物浓度的各杂质量添加至被测物中，模拟被测物中可能存在杂质的状态，即有少量(约1％)杂质存在时能否与被测物达到完全分离(分离度大于1.5)，以验证系统适用性。 只有这样才能较为客观、科学地反映被测物的实际情况。而不应将被测物与各杂质配制成相同浓度的溶液，因为实际检测中不可能存在这种情况，且该浓度也不易确定。在实际检测时，由于被测物浓度较大，很易将相邻杂质峰包含其中。 另外还需测定溶剂和辅料(检测制剂时)是否有干扰。目前，美国药典(USP)、英国药典(BP)及许多进口产品的质量标准中，有关物质测定方法学的专属性验证均采用此法。还须说明的是：杂质与杂质峰间的分离度达1.2即可，而被测物与其相邻杂质峰的分离度必须大于1.5。 有关物质检测的研究对象是杂质，而非被测物。但测定则是通过各自的峰面积来表达，故波长的选择必须考虑被测物和各杂质在检测波长下的校正因子(f)是否相同。应分别制备相同浓度的被测物与各杂质溶液，经紫外扫描后以吸光度相近的波长为检测波长。 在该检测波长下，分别进样测定，由各峰面积计算校正因子。若 f 为0.8～1.2，则表明被测物与各杂质的f相同，可消除 f 的影响。若f≤0.8或f ≥1.2，则应在计算时加入 f。目前通常以被测物的最大吸收波长为检测波长、不加校正因子的计算方法，而未综合考虑各杂质的 f 。 供试品溶液浓度的确定也非常重要。虽然浓度越高越能反映被测物中杂质存在的情况，但若设定过高，会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况；若设定过低，则灵敏度不够，无法检测杂质及其含量变化。 最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评价法两种。后法是目前较为科学的做法，即将仪器的灵敏度调至较适宜的值(仅对灵敏度可调节的仪器而言，目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已设定了一个恒定、较为灵敏的值)，然后将被测物溶液不断稀释后进样测定，直至被测物峰面积无法检出为止，此时的浓度即为最低检出浓度。 最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓度，直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况出现。 根据最低检出浓度，采用“上推法”来确定供试品溶液浓度：如一般设定杂质总量小于1.0％对照液，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的20～50倍，供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。 同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。 表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10μl，规定杂质限度1.0％)。
在稳定性考察中，如某杂质含量不断增加，则说明被测物降解的途径稳定、可循，则有必要对该杂质进行针对性地监控，即采用该杂质对照品(经确证结构后，由人工合成获得)以外标法准确测定。此时，与含量测定相似，应进行线性试验。 通常将杂质限度设定为该杂质的100％浓度，线性验证范围10％～150％(即相当于被测物测定浓度的1.5％～0.1％)。且精密度试验也应符合要求，但RSD可根据实际情况，适当放宽至3.0％～5.0％。 回收率试验采用在已知杂质含量的被测物中加入定量杂质的方法来评价。将各杂质以1％(w/w)的浓度加至被测物溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检测相应的各杂质以及与被测物中已存在的杂质是否累加，并观测累加量的准确性。
该项研究是为了揭示原料药的内在稳定性，它也是研发中必不可少的一部分。这些试验是在比加速试验更剧烈的条件下进行，包含了药品在销售、运输过程中可能遇到的各种复杂剧烈情况，以证明在所选色谱条件下，能否分别检测在此剧烈条件下所产生的杂质。 强力破坏试验条件有强光、高温、高湿、强酸、强碱、氧化破坏等。破坏时不能过于剧烈，一般以产生20％～30％杂质的条件为宜(《化学药物杂质研究技术指导原则》，国家食品药品监督管理局药品审评中心)。同时，还可采用二极管阵列检测器(DAD)或质谱(MS)监测器进一步验证主峰纯度，观察主峰中是否包含有被破坏产生的杂质峰。 当某杂质在稳定性试验中不断增加，且又主要是在某一强力破坏试验条件下产生，则应在质量标准中的系统适用性试验里，采用供试品溶液有针对性地进行强破坏处理，以验证在该试验状态下所产生的杂质与被测物能否完全分离。 如奥美拉唑钠易氧化破坏，因此注射用奥美拉唑钠的国家药品标准[WS1-(X-350)-2004Z]中规定，采用经3％过氧化氢溶液氧化破坏的奥美拉唑钠溶液为系统适用性试验溶液。
流速的选择：主峰保留时间应在10min以后，这样主峰不易出现拖尾、堆积的现象。 柱温的选择：不应超过35℃，既可增强被测物与杂质的分离度，也可避免因温度过高使主峰降解，导致测定误差。 溶剂的选择：由于有关物质测定的供试品溶液浓度高，应首先考虑被测物在溶剂中的稳定性一般选流动相作溶剂为宜，以排除溶剂峰的干扰。但由于有关物质的测定必须扣除溶剂峰，因此只要溶剂峰不干扰被测物质峰，即使不选用流动相作溶剂，也完全可以。 一些质量标准制订时片面追求采用流动相作溶剂，有可能未将被测物全部溶解(由于有关物质测定多选用自身对照法，故未能发现)。在流动相溶解性不佳时，可采用甲醇或乙腈作溶剂以提高溶解性。 色谱图记录时间的设定：应能洗脱出有可能存在的全部杂质和经强力破坏试验产生的杂质，并规定至主成分保留时间的几倍为止。在测定制剂的有关物质时，个别辅料出峰滞后，此时应在质量标准中注明。 如盐酸贝那普利片的国家药品标准[YBH13652004]中，有关物质测定项下规定：记录供试品溶液色谱图至主成分峰保留时间的10倍，供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和(扣除溶剂峰、溶剂峰前的辅料峰及主峰保留时间7倍后的辅料峰)。 积分参数的设定：色谱峰峰面积的大小主要由斜率和峰宽两个积分参数决定。斜率越大，切线的倾斜角越大，峰面积越小；而峰宽一般无规律可循。此外还有一个非常重要的参数是最小峰面积。 该参数设定得越大，杂质峰越不容易被积分检出，被测物杂质含量就易合格。关于最小峰面积的设定，目前国内还没有一个定论，因此经常会在一些杂质总量稍多、杂质含量处于边缘时，产生检验结论的分歧。 建议借鉴英国药典(BP)的做法，即在所有采用HPLC法检测有关物质的品种项下，均规定舍弃对照溶液主峰面积1/20以下的峰。也就是说0.05％以下的杂质峰可被认为与噪音相当、无必要积分。中国药典2000年版二部中仅有头孢克洛、头孢呋辛钠和硝苯地平3个品种项下有此规定；而2005年版二部中已增至25个品种，但均为抗生素品种。
8.1 二极管阵列检测器应用价值 DAD检测器是对一个色谱峰的几点进行紫外扫描，然后对所得图谱进行比较以评价峰纯度。但该检测器功能有一定的局限性，只有当杂质紫外扫描图谱与主成分紫外扫描图谱有明显不同时，才会有比较好的辨别功能。 8.2 质量标准中的系统适用性试验 将与被测物峰最难分离的杂质以被测物浓度1％来验证，从而确保即时试验的专属性。英国药典和许多进口药品质量标准均这样拟定，而目前国内很少做到。 8.3 自身对照法和归一化法的区别 将供试品溶液稀释100倍后，所得的1％对照溶液主峰面积应为供试品溶液主峰面积的1/100。如相差甚远，即说明稀释100倍后主峰峰面积不呈线性，则必须采用自身对照法；如测定结果一致，则在稳定性试验中便可采用归一化法。但在质量标准中仍建议拟定为自身对照法。 对大部分药品，以上两法的测定结果均基本一致。其原因为：绝大部分药品均是由碳、氢、氧、氮元素组成，该构成决定了在紫外检测器上，物质的线性范围均可达到1～106，只有少数物质，才会出现线性范围很窄的现象。如唑来磷酸，其线性范围就只有1～102，且须进行多次寻找才能找到适宜的浓度范围。 8.4 HPLC法与TLC法检测有关物质时的优缺点 HPLC法虽然优点众多，但并不能完全替代TLC法。HPLC法可认为是在反相色谱上对被测物的检测，TLC法则是在正相色谱上对被测物的检测。目前国内有的质量研究中，盲目、片面采用HPLC法的做法是不可取的。 只有将两法有机地结合、彼此间进行对比研究，取长补短，才能得到更全面、准确、清晰的杂质信息，所得结果才更客观和科学。这也正是国外药典对一些品种同时采用以上两种方法进行有关物质检测的合理性所在。 |
